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Comment la mesure de capacitance améliore-t-elle la production de vecteurs viraux ?

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En 2020, la pandémie de coronavirus a introduit et accéléré le développement sans précédent de vaccins pour prévenir la COVID-19. Certains de ces vaccins (AstraZeneca, Janssen) sont basés sur des virus adéno-associés (AAV) non pathogènes, porteurs du vecteur viral d’intérêt.

Bien que ces procédés soient connus et utilisés depuis plusieurs décennies, leur production à grande échelle n’en reste pas moins complexe et différents paramètres sont à prendre en compte comme la densité, la taille des cellules ainsi que les temps optimaux d’infection et de récolte du virus.

Paramètres et attributs critiques

La détermination de ces paramètres permet de maintenir les attributs de qualité critiques (CQA) du vaccin tout en optimisant par la suite les coûts et délais associés aux étapes de purification. En effet, des périodes de récolte incorrectes peuvent produire des quantités excessives de débris cellulaires nécessitant une clarification et une purification plus coûteuses.

Stratégie de montée en échelle

La montée en échelle des procédés de production de vecteurs viraux peut être difficile et nécessiter une optimisation en flasques agitées ou mini-bioréacteurs. Ce processus peut être coûteux en temps et en ressources ; auxquels s’ajoute une fabrication également plus coûteuse en utilisation de milieux, tampons et réactifs.

Privilégier les analyses en ligne pour une démarche PAT

Pour optimiser ces étapes, il est essentiel de trouver une méthode permettant de surveiller les cellules pour leur concentration au sein de la culture, mais également pour leur taille afin de déterminer lorsqu’une culture a été infectée avec succès. Les technologies compatibles avec une démarche PAT (Process Analytical Technology) privilégient un contrôle du procédé en temps réel.

Les avantages de l'analyse in-situ

L'utilisation d'une technique d'analyses en ligne, in situ, fournit des données en temps réel permettant le suivi détaillé des paramètres de procédés critiques (CPP) et des indicateurs clés (KPI), offrant ainsi un contrôle de la culture avec des retours automatisés possibles.

La mesure de la capacitance permet de relever de nombreux défis de surveillance et contrôle de procédés associés à la production de vaccins à base de vecteurs viraux ou virus.

La capacitance pour le suivi en ligne des cellules

Le principe de mesure

La mesure repose sur la capacité de polarisation des cellules vivantes.

Une cellule en culture en suspension possède une membrane externe bicouche non conductrice, imperméable aux ions. Le milieu dans lequel elle se développe est une suspension d'ions. Sous l'influence d'un champ électrique, les cellules se polarisent.

Principe mesure capacitance
 
  • Si une cellule est vivante et sa membrane intacte, elle agit comme un condensateur pour stocker l'énergie électrique. À mesure que le nombre de cellules et les volumes de culture augmentent, le nombre de membranes cellulaires polarisées augmente également, ce qui augmente la capacitance.
    Ainsi, la capacitance d'une suspension cellulaire est directement proportionnelle au volume total lié à la membrane des cellules.
  • Les cellules mortes, aux membranes endommagées, ainsi que les particules solides et les bulles de gaz sans membranes cellulaires, ne peuvent pas stocker de charge électrique et ne contribuent donc pas à la capacitance dans une suspension cellulaire.

La technologie de mesure

La société Aber Instruments (Aberystwyth, Royaume-Uni), pionnier dans le domaine, a développé une technologie permettant de créer et mesurer la capacitance au sein d’une culture.

L'instrument se compose d'une sonde avec une électrode interne et externe ainsi que l'électronique associée pour permettre l'acquisition des données.

Sonde capacitance
L'électrode externe crée un champ d'environ 30 à 40 mm dans le spectre RF (entre 50 kHz et 20 MHz). Un capteur mesurant la tension en pico-Farads (pF) / cm et pouvant être intégré dans un système de contrôle permet de capturer les données en continu.

La mesure de la capacitance a été largement utilisée dans le développement biopharmaceutique depuis les années 1990 pour la surveillance des cultures cellulaires dans les laboratoires R&D jusqu'aux installations de production.

La technologie est disponible sous différents formats s’adaptant ainsi aux différents systèmes allant des petits bioréacteurs en verre aux plus grands en acier inoxydable, en passant par les dispositifs à usage unique.

Les différents modèles de sondes disponibles

Le suivi des productions virales par capacitance

La mesure de la capacitance est considérée comme la méthode en ligne la plus précise pour surveiller la densité de cellules vivantes dans les cultures de cellules de mammifères.

Elle peut également être utilisée pour surveiller la production de vaccins viraux. Lorsque les cellules infectées par le virus sont surveillées avec une capacitance, elles présentent une courbe de croissance typique.

courbe capacitance culture virus

Comment utiliser la capacitance? 

Les mesures peuvent être utilisées pour surveiller la croissance des cellules hôtes en temps réel. Cela permet une identification automatisée du point d'infection optimal :

  • lorsque les cellules sont infectées, leur volume commence par augmenter, ce qui se traduit par une forte augmentation de la capacitance. Lorsque celle-ci est maximale, les cellules sont au pic de l'infection et donc de leur taille maximale.
  • une fois que les cellules ont atteint leur capacité maximale d'infection, elles se lysent et meurent pour libérer les virus. Ceci se traduit par une forte diminution de la capacitance car les cellules mortes ne peuvent plus contenir de charge électrique.

L'utilisation de la capacitance permet d’identifier, optimiser et automatiser le moment optimal de récolte.

Etudes de cas et applications *

Surveillance de cellules infectées par des vecteurs Baculovirus

Des scientifiques de l'Institut de Recherche en Biotechnologie au Canada ont utilisé une sonde de capacitance Aber Instruments pour le suivi de cellules d'insectes Spodoptera frugiperda (Sf9).

En comparant les données de capacitance obtenues avec les mesures hors ligne de VCD et de la taille des cellules, ils ont constaté que les profils correspondaient étroitement pendant la phase de croissance cellulaire.

La mesure de la capacitance est un bon indicateur de l’infection baculovirale et fournit des informations précises sur l’état physiologique des cellules. Combinée avec la mesure de paramètres tels que le volume cellulaire, elle permet de contribuer à une compréhension détaillée des procédés.

Suivi du volume cellulaire pour la production de AAV

Deux études sur la production de vecteurs viraux AAV de l'Institut de Recherche en Biotechnologie au Canada ont montré que la mesure de capacitance permettait de mesurer les changements de volume cellulaire. Elle offre également une méthode de surveillance en ligne rapide et précise pour prédire les temps où les cellules HEK293 ont été infectées avec succès par l'AAV et l’infection est à son apogée.

Savoir quand le pic d'infection s'est produit aide également à déterminer le point de récolte optimal pour une productivité maximale des vecteurs viraux AAV.

Surveillance du volume cellulaire et de l'adhésion aux microporteurs avec le virus de la rougeole

Dans une étude de l'Université des Sciences Appliquées de Mittelhessen en Allemagne, des chercheurs ont intégré un capteur de capacitance dans un bioréacteur pour caractériser un procédé de production du virus de la rougeole à l'aide de cellules Vero adhérentes cultivées sur des microporteurs.

La capacitance est utilisée pour surveiller l'adhésion des cellules sur les microporteurs en déterminant le temps d’adhésion et les résultats montrent qu’elle aide à prédire à quel moment les cellules Vero ont adhéré pleinement aux microporteurs et quand récolter le virus pour des titres optimisés.

Etude de montée en échelle

Pour démontrer l'évolutivité de la technologie de mesure de capacitance, les scientifiques de Biogen, dans une étude de 2019, ont utilisé un capteur de capacitance Aber pour surveiller des cultures d'ovaires de hamster chinois (CHO) à l'échelle laboratoire (5 L), pilote (200 L, 315 L) et production (15 000 L). Les résultats obtenus illustrent cette cohérence des données entre les différentes échelles, du laboratoire à la production, permettant de réduire les délais de développement de la stratégie d'alimentation pour la production de vecteurs viraux ou de virus.

De plus, la capacitance fournit des informations sur les performances de culture qui ne peuvent pas être réalisées à l'aide de méthodes de comptage cellulaire traditionnelles en ligne ou hors ligne.

La mesure de la capacitance peut-elle aider à maintenir des cultures cellulaires intensives? 

Pour automatiser et contrôler un procédé de culture cellulaire à haute densité, un capteur de capacitance Aber est intégré dans un bioréacteur (à usage unique ou en acier inoxydable) et contrôlé par une unité de contrôle automatisée, pilotée par logiciel.

Au fur et à mesure que les cellules se développent dans le bioréacteur, leur capacitance augmente.

culture intensive virus

Si la VCD, mesurée par capacitance, dépasse un point de consigne cible, le contrôleur ordonne à une pompe péristaltique de retirer des cellules du bioréacteur pour effectuer une purge cellulaire automatisée à un taux défini déterminé par celui de la croissance cellulaire.

Le contrôleur demande également à la pompe d'alimentation d'ajouter du milieu pour maintenir la VCD à un point de consigne.

La mesure de la capacitance peut être appliquée dans une boucle de régulation pour empêcher la prolifération cellulaire dans les cultures intensives de production de vecteurs viraux et de vaccins à base de virus. Le capteur surveille le volume des cellules vivantes en temps réel.

La mesure de la capacitance est donc un outil PAT clé, offrant de nombreux avantages pour surveiller, contrôler et optimiser la production de vecteurs viraux et de virus.

* Découvrez l’ensemble des détails de ces études  dans l’article d’Aditya Bhat, expert de la technologie

 

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